METODE ISPITIVANJA SEMENA I NORME KVALITETA SEMENA

1. Pribor, oprema i postupci koji prethode ispitivanju

1.1. Pribor za uzimanje uzoraka koristi se za uzimanje pojedinačnih uzoraka semena iz ambalaže, odnosno iz pakovanja određene partije semena:

1.1.1. Šiljasta sonda se sastoji iz spoljašnje čvrste cevi koja se završava izduženim šiljkom. Spoljašnja cev ima otvore, koji se mogu poklopiti sa otvorima unutrašnje rotirajuće cevi. Kad se sonda zabode u sadržaj semena, unutrašnja cev je okrenuta za polovinu obrtaja, tako da seme ne može ulaziti u sondu. U trenutku uzimanja uzorka seme ulazi u sondu ili prolazi kroz sondu u određenu posudu, za pojedinačni uzorak, tako što se unutrašnja cev okrene u položaj u kome se otvori spoljašnje i unutrašnje cevi poklope.

Uzorci deteline i drugih vrsta sitnog semena, koje je veoma sipko, uzimaju se sondom dužine 762 mm, prečnika 25,4 mm, sa 6 otvora.

Uzorci iz partije semena u rasutom stanju uzimaju se na istom principu kao i uzorci iz vreća, ali pomoću znatno duže sonde (do 1.600 mm), većeg prečnika spoljašnje cevi (do 38 mm) i sa 6 ili 9 otvora. Tom sondom uzimaju se uzorci svih vrsta i iz svih tipova pakovanja, kao i semena u rasutom stanju, osim veoma plevastog semena. Posle uzimanja uzoraka papirne vreće se lepe posebnim lepljivim trakama.

1.1.2. Nobeovo šuplje šilo dugačko je 500 mm, a sastoji se od cevi sa zašiljenim vrhom i sa izduženim otvorom prema zašiljenom delu šila. Unutrašnji prečnik šila namenjenog za uzimanje uzorka žita iznosi oko 14 mm, a za seme detelinskih vrsta i ostalo slično seme - oko 10 mm.

Nobeovo šuplje šilo isključivo služi za uzimanje uzoraka iz vreća. Šilo se ubada u vreću otvorom nadole, pod uglom od 30°. Otvorom šila dopre se do sredine vreće, šilo se obrne za 180o (da se otvor okrene nagore), pa se šilo lagano izvlači, s tim što se brzina izvlačenja smanjuje, srazmerno približavanju otvora šila perifernom delu ambalaže.

1.1.3. Rukom se uzimaju uzorci semena koje nije sipko, kao i krtola i lukovica, pri čemu ruka mora biti čista i suva. Ako se uzorak uzima rukom (pojedinačan uzorak) iz ambalaže dublje od 40 cm, seme treba istresti na odgovarajuću prostirku i uzeti određeni broj uzoraka pa ga ponovo vratiti u ambalažu i propisno je zatvoriti. Pri izvlačenju uzetog uzorka šaka mora biti čvrsto zatvorena, kako sadržaj uzorka ne bi ispadao.

1.2. Uzimanje uzoraka semena na liniji dorade može se vršiti posebnim, za tu svrhu ugrađenim, automatskim uzimačem uzoraka. Na taj način dobije se zbirni uzorak iz koga se, po propisanom postupku, na licu mesta formiraju prosečan uzorak i uzorak za vlagu.

1.3. Metode za pripremanje radnog uzorka

Radni uzorak predstavlja odgovarajući deo mase prosečnog uzorka i služi za ispitivanje i utvrđivanje čistoće, klijavosti, zdravstvenog stanja i za druga ispitivanja.

Radni uzorak može se dobiti primenom sledećih metoda i postupaka, koji se razlikuju zavisno od fizičkih osobina semena pojedinih vrsta bilja.

1.3.1. Metoda upotrebe aparata podesnog za deljenje, koji se može koristiti za sve vrste semena, osim za neke ekstremno plevaste vrste.

Pomoću aparata za deljenje uzorak semena se podeli na približno jednake polovine. Jedna polovina deli se dalje sve dok se ne dobije određena količina radnog uzorka.

Za deljenje uzorka upotrebljavaju se sledeći aparati:

1. konus tip (Boerner),
2. jednostavni aparat za deljenje (Soil divider) i
3. centrifugalni aparat za deljenje (Gamet tip).

1.3.2. Metoda slučajnih posuda primenjuje se za vrste biljaka za koje je radni uzorak preko 10 g.

Na posudu kvadratnog oblika (tacnu) razmesti se po slučajnom rasporedu 6 do 8 posudica jednake veličine (čaše, lončići i dr.). Iz posude u kojoj se nalazi prosečan uzorak seme se ravnomerno rasipa po celoj površini u jednom smeru, a zatim u suprotnom smeru. Seme koje se zadržalo u posudicama predstavlja radni uzorak. Ako je potrebno da se količina semena koja se zadržala u posudicama smanji, seme iz posudica ponovo se izmeša i postupak ponovi. Veličina posudice određuje se prema krupnoći semena.

Ova metoda nije preporučljiva za ekstremno plevasto seme i seme koje se odbija i odskače od površine (npr. Brassica spp.).

Tabela 1
Primer veličina posudica u kvadratnoj posudi

1.3.3. Prilagođena metoda polovljenja primenjuje se tako što se seme sipa iznad posebne plitke posude koja ima paran broj četvorougaonih komorica (od kojih je svaka druga bez dna). Kad se posuda podigne polovina uzorka ostaje u sudu postavljenom ispod nje i na taj način uzorak sadržan u posudi smanjuje sve dok se ne dobije određena količina radnog uzorka.

1.3.4. Metoda polovljenja kašikom: seme se prethodno dobro izmeša, zatim ravnomerno rasipa po celoj podlozi i u sloju jednake debljine. Kašikom u jednoj i pomoćnim lenjirom u drugoj ruci uzima se seme sa najmanje pet proizvoljno raspoređenih mesta dok se ne dobije propisana težina radnog uzorka.

Ova metoda se primenjuje samo za vrste veoma sitnog semena (npr. Petunia).

1.3.5. Metoda ručnog polovljenja primenjuje se isključivo za plevičasto seme (Andropogon, Arrhenatherum) tako što se:

• seme ravnomerno rasporedi po glatkoj ravnoj površini;
• seme dobro izmeša ravnom ivicom lenjira;
• gomila podeli na dva dela, a svaki deo dobro izmeša i ponovo deli. To se ponavlja dok se ne dobije osam gomilica, koje se poređaju u dva reda. Zatim se iz prvog reda izdvoje gomilice 1 i 3, a iz drugog 2 i 4, koje se izmešaju. To se ponavlja dok se ne dobije veličina radnog uzorka.

1.3.6. Radni uzorak semena Beta spp., klupčastog i segmentiranog, uzima se iz dobro izmešanog prosečnog uzorka u količini od 2 - 25 g.

1.3.7. Radni uzorak semena sa omotačem uzima se iz dobro izmešanog prosečnog uzorka od 250 g, zatvorenog u nepropustivoj ambalaži. Radni uzorak izdvaja se aparatom za deljenje (Soil divider) u koji se sipa seme sa visine od 25 cm. Uzima se 2 - 50 g (ne manje od 45 g i ne više od 55 g), sa 2.500 peleta. Ako je uzorak manji, u izveštaju je potrebno navesti broj peleta. Ta se količina presejava sistemom sita sa okruglim otvorima, i to:

• donje sito sa otvorima 0,25 mm manjim od najniže nominalne veličine semena;
• serija sita koja dele preostalo seme po veličini u frakcije po četvrtini milimetra;
• sito sa otvorima 0,25 mm većim od gornje nominalne veličine semena.

Prosejane frakcije (uključujući i deo koji je prošao kroz najmanje sito) izmere se sa tačnošću na dva decimalna mesta. Frakcije se izražavaju procentom na jedno decimalno mesto od ukupne mase. Prosek vrednosti za dva radna uzorka predstavlja rezultat analize, ako razlike između suma i unutar određenih frakcija nisu veće od 1,5%. Ako je ta tolerancija prevaziđena, uzima se treći uzorak od 50 g, a ako je potrebno, i četvrti uzorak.

2. Čistoća semena

2.1. Pod čistoćom semena podrazumeva se odnos količine čistog semena vrste koja se ispituje i količina semena drugih vrsta poljoprivrednog bilja, korova i internih materija zajedno.

2.2. Pod čistim semenom podrazumeva se seme koje pripada deklarisanoj vrsti ili koje je kao takvo identifikovano u laboratoriji za ispitivanje semena:

• zrelo i neoštećeno seme i plodovi normalne veličine;
• nedozrelo, šturo ili isklijalo seme iznad polovine normalne veličine;
• delovi semena i plodova veći od polovine normalne veličine;
• seme kome nedostaje ljuska - semenjača (Leguminosae i Cruciferea), kao i golo seme suncokreta do 1%;
• seme (botanički plodovi), bez obzira na to da li sadrži pravo seme (Beta, Tetragonia) i jednosemeni plodovi (Valerianella, Cichorium, Lactuca, Helianthus i Fagopyrum) i mahune ili delovi mahuna sa jednim semenom;
• jednosemeni ili dvosemeni plodovi iznad polovine normalne veličine (Umbeliferae), bez obzira na to da li imaju pravo seme;
• plodovi semena koje bez izduvavanja, stereoskopa, diafanoskopa ili drugih aparata, odredimo i čisto seme, ako klica nije vidljiva;
• cvetići trava i žitarica sa vidnom kariopsom, uključujući i endosperm sa steritnim cvetićima ili bez sterilnih cvetića;
• gole kariopse trava i žitarica iznad polovine normalne veličine;
• frakcije čistog semena trava, separirane primenom posebnih metoda;
• klupka ili delovi klubaka Beta vrsta sa pravim semenom ili bez pravog semena, koji ostanu na situ veličine 200 - 300 mm sa pravougaonim otvorima veličine 20 - 1,5 mm posle jednog minuta prosejavanja. Klupko ili delovi klubaka monogermih vrsta, uključujući peteljku, koja nije duža od debljine klupka, bez vidno prisutnog semena, delimično ili sasvim golo seme, iznad polovine normalne veličine.

2.3. Seme drugih vrsta i seme korova čine sve vrste semena, osim čistog semena, koji ispunjavaju uslove za čisto seme iz tačke 2.2.

2.4. Inertne materije obuhvataju delove semena (zrna) vrsta poljoprivrednog bilja i korova, kao i strane primese koje ne potiču od semena, i to:

• delovi polomljenog ili oštećenog semena manji od polovine normalne veličine;
• seme bez semene ljuske (Leguminosae i Cruciferae) i golo seme suncokreta preko 1%;
• prazne plevice i slobodni prazni cvetići;
• cvetići vrsta trava sa kariopsom manjom od propisane. Odlomljeni sterilni cvetići, osim kod trava (Arrhenatherum, Avena, Chloris, Dactylis, Festuca, Holcus, Poa i Sorghum), kod kojih sterilni cvetići ostaju;
• klupka i delovi klubaka Beta vrsta, koji su pali kroz sito sa pravougaonim otvorima veličine 20 - 1,5 mm posle prosejavanja od 1 minute (tresenja, vibriranja), osim genetički monogermnih vrsta. Mahune i čahure sa semenom treba otvoriti, izvaditi seme i grupisati ga u čisto seme, a ostale delove svrstati u inertne materije;
• oštećeno seme bez embriona, sterilni cvetići, prazne pleve, peteljke, listići, šturo i lako lomljivo seme, "crno seme" (Plantago lanceolata), bez obzira na to da li je deformisano, grudvice zemlje, peska, kamenčići, pleva, delovi stabljika, komadići drugih delovi biljaka i ostale primese koje nisu seme;
• otpadni materijal, lake frakcije dobijene primenom metode izduvavanja.

2.5. Ispitivanje čistoće semena sa omotačem: omotač semena treba da bude ispran ili uklonjen u suvom stanju. Seme u trakama uklanja se sa trake tako da se za ispitivanje dobije 100 semena (ljuštenje, natapanje). Ako je i to seme obloženo, primeniće se postupak predviđen za takvo seme. Radni uzorak treba da sadrži najmanje 2.500 semena, koja se potapaju u vodu na malom situ i tresu. Preporučuje se sito dimenzija otvora 0,5 do 1,0 mm. Omotač semena ispira voda, seme se tokom noći suši na filtrir-papiru, a zatim u peći, prema metodi propisanoj za ispitivanje vlage za pojedinu vrstu. Čistoća se ispituje na način koji je naveden za ispitivanje čistoće semena (čisto seme, primese drugog poljoprivrednog bilja, korovi i mrtve primese). Količina omotača semena utvrđuje se samo ako se to izričito zahteva.

2.6. Načela postupka

2.6.1. Ispitivanjem čistoće semena utvrđuju se sastavni delovi radnog uzorka semena, kao i identičnost različitih vrsta semena i inertnih materija. Pri ispitivanju čistoće semena, uzorci se razdvajaju na četiri osnovne grupe:

• 2.6.1.1. čisto seme osnovne kulture;
• 2.6.1.2. seme drugih vrsta;
• 2.6.1.3. seme korova;
• 2.6.1.4. inertne materije.

2.6.2. Čistoća semena se izražava u procentima, na osnovu merenja dobijene mase za svaku od izdvojenih grupa.

2.7. Aparati: pomoćna sredstva (lupe, refleksna svetla, sita i duvaljke) upotrebljavaju se za deljenje semena u frakcije, kao i za odvajanje primesa iz semena.

2.8. Radni uzorak: analiza čistoće vrši se na radnom uzorku koji je formiran iz prosečnog uzorka po jednoj od metoda iz tačke 1.3. Radni uzorak mora imati najmanje 2.500 semena. Analiza se radi na jednom radnom uzorku ili na dva radna uzorka čija je masa jednaka najmanje polovini mase celog radnog uzorka.

Rezultati merenja svake od četiri izdvojene osnovne grupe izražavaju se u gramima i sa više decimalnih mesta. Broj decimalnih mesta zavisi od mase propisane za radni uzorak.

Tabela 2
Masa radnog uzorka i broj decimalnih mesta pri merenju

2.9. Separiranje

2.9.1. Sve familije, osim familije Graminea: seme i plodovi se ispituju površinski, bez upotrebe pritiska, povećala, diafanoskopa ili drugih posebnih aparata. Ako se zapazi da je plod bez semena, smatra se inertnom materijom.

2.9.2. Gramineae: kariopse vrsta Lolium, Festuca i Agropyron repens u dužini jedne trećine ili više od gornje pleve (palea), merene od baze, smatraju se čistim semenom. Ako je kariopsa kraća, odvaja se u inertne materije. Kod drugih rodova ili vrsta cvetić sa endospermom i kariopsom ubraja se u čisto seme. Ako sterilni klasići kod vrsta Arrhenatherum, Avena, Dactylis, Festuca, Holcus, Poa i Sorghum nisu odlomljeni i odvojeni od fertilnih klasića, svrstavaju se u čisto seme, što se odnosi i na Lolium, ako sterilni klasić ne prelazi dužinu fertilnog klasića bez rese.

2.9.3. Oštećeno seme se određuje po osnovu tačke 2.2. (pravilo polovine semena).

2.9.4. Neodređene vrste: ako se neka biljna vrsta ne može identifikovati, navodi se samo ime roda (npr. Lolium sa resama ili bez resa) kao čisto seme, a slično seme se oduzme iz ostalih frakcija i meri zajedno. Iz mešavine se slučajnom metodom oduzme 400 do 1.000 semena, ceparira uzorak i količinski determiniše i, po osnovu iz tačke 2.10, izračuna konačni rezultat. Frakcije se navode po broju semena, a ovaj metod se primenjuje ako je pošiljalac naveo vrste Agrostis, Brassica, Lolium, Poa, Festuca ili u slučajevima koje izabere analitičar.

2.9.5. Metoda izduvavanja obavezna je za vrste Poa pratensis i Dactylis glomerata. Masa radnog uzorka iznosi 1 g za Poa pratensis i 3 g za Dactylis glomerata. Pre kalibriranja seme treba da bude na sobnoj temperaturi. Radni uzorak stavlja se u cev duvaljke (izduvavanje se reguliše prema uputstvima datim za tu vrstu aparata) i izduvava 3 minuta.

2.9.6. Podela teže frakcije: iz ostataka u cevi posle izduvavanja, u čisto seme ubrajaju se neoštećeni jednocvetni klasovi, svi neoštećeni višecvetni klasovi za Poa pratensis i višesemenske jedinice Dactylis glomerata, cvetni klasovi sa gljivičnim plodištima (kao sklerocije i Claviceps) zatvoreni između pretpleve i površinske pleve, cvetni klasovi i kariopse koji su oštećeni od štetočina ili oboleli (uključujući prazne naborane, izbledele ili smrvljene kariopse) i slomljeni klasovi ili kariopse veći od polovine normalne veličine. Cvetni klasovi sa vidljivim sklerocijama, slomljeni klasovi i kariopse, kao i sve ostale primese organskog i neorganskog porekla su mrtve primese, odnosno seme drugog bilja.

2.9.7. Podela lakše frakcije: svi cvetni klasovi i kariopse u lakšoj frakciji su mrtve primese. Drugo seme (i Poa spp. u Poa pratensis), stabalca, listići, pesak i sl. svrstavaju se u druge vrste semena i mrtve primese, u skladu sa metodikama za ispitivanje čistoće. Ako fertilnih klasova Poa spp. ima 1 od 3% u Poa pratensis, lakše je odabrati sve klasove iz teže i lakše frakcije i označiti ih zajedno kao primese ostalog poljoprivrednog bilja. Ako je taj procent veći, postupa se prema alternativnom metodu.

2.9.8. Aletnativni metod za utvrđivanje Poa spp. u Poa pratensis: po slučajnom izboru odabere se 400 do 1.000 fertilnih cvetnih klasića izdvojenih iz obe frakcije, utvrde se pojedine Poa spp. pod stereoskopom i determiniše procent svake od tih vrsta.

2.9.9. Višesemenske jedinice: kod vrsta Dactylis i Festuca posebno se mere višesemenske jedinice, i to: fertilni klasić sa jednim pripojenim sterilnim klasićem ne dužim od vrha fertilnog klasića bez rese; fertilni klasić sa više fertilnih ili sterilnih klasića dužine fertilnog klasića; fertilni klasić sa sterilnim klasićem pripojenim na rahilu (cvetnu peteljku), bez obzira na dužinu. Klasići sa jednim fertilnim i sterilnim klasićem kraćim od vrha fertilnog klasića bez rese smatraju se jednosemenskim grupama. Sterilni klasić nije odlomljen od fertilnog klasića. Višesemenske jedinice posebno se mere i izračunavaju po postupku iz tačke 2.11.

2.10. Obrada rezultata za neodređene vrste

Količinski prosek komponente je zbir masa te komponente iz svih uzoraka podeljen zbirom masa svih komponenata iz svih uzoraka i pomnožen sa 100. Formula:

pri čemu je:
m - masa čitavog uzorka;
m₁ - masa sličnog semena iz radnog uzorka;
m₂ - masa frakcije 400 ili 1.000 sličnih semena uzetih za konačnu separaciju;
m₃ - masa tražene vrste, u m2.

2. 11. Dobijanje rezultata

Rezultat čistoće izračunava se na jednu decimalu, a sve komponente treba da iznose 100%. Za komponente manje od 0,05%, navodi se: "u tragovima".

U izveštaju se mora navesti latinski naziv nađenih drugih vrsta i korova, a mogu se nabrojati i intertne materije. Ako je jedna vrsta u frakciji iznad 1% ili ako podnosilac prijave za ispitivanje semena zahteva pojedinačne rezultate iznad 0,1%, onda se za te slučajeve posebno navodi procent.

2.12. Tolerancije

2.12.1. Ako se čistoća semena ispituje na dve polovine jednog radnog uzorka ili na dva radna uzorka, proverava se da li su rezultati ispitivanja u granicama dozvoljenih odstupanja. Ako rezultati ispitivanja čistoće semena nisu u granicama dozvoljenih odstupanja, određivanje čistoće ponavlja se na isti način još jedanput ili više puta. Kao konačni rezultat ispitivanja uzimaju se prosečne vrednosti čistoće dobijene posle svih ispitivanja.

Tabela 3
Dozvoljena odstupanja za ispitivanje čistoće semena dva radna uzorka, dobijena iz istog prosečnog uzorka (za plevičasto i neplevičasto seme), sa verovatnoćom od 0,05

2.13. Prisutnost svih drugih vrsta bilja koje ne pripadaju partiji semena čiji se uzorak ispituje, utvrđuje se iz uzorka za određivanje prisustva drugih vrsta uzetog iz prosečnog uzorka te partije semena.

2.13.1. Ako nije moguće utvrditi vrstu, navodi se rod.

2.13.2. Ispitivanje se prekida u trenutku kad se pronađe vrsta čije se ni jedno zrno ne sme naći u uzorku (npr. Cuscuta, Orobanche i dr.).

2.13.3. Rezultat ispitivanja navodi se brojem nađenih zrna drugih vrsta i u procentu. Razlika rezultata ispitivanja dva uzorka ne sme biti veća od dozvoljenog odstupanja (tolerancije iz tabele 4).

Tabela 4.
Tolerancije za rezlutate dva ispitivanja sa verovatnoćom od 0,05

3. Klijavost semena

3.1. Pod klijavošću semena podrazumeva se ispitana i utvrđena energija klijanja i klijavost semena iz uzorka jedne partije semena u laboratorijskim uslovima.

3.1.1. Energija klijanja predstavlja broj normalnih klijanaca u odnosu na broj semena stavljenih na klijanje utvrđen posle isteka vremena predviđenog za prvo ocenjivanje, odnosno utvrđivanje energije klijanja.

3.1.2. Klijavost semena predstavlja broj normalnih klijanaca u odnosu na ukupan broj semena stavljenih na klijanje utvrđen posle isteka vremena predviđenog za završno ocenjivanje.

3.1.3. Energija klijanja i klijavost semena izražavaju se u procentima i saopštavaju u izveštaju.

3.1.4. Normalni klijanci, zavisno od biljne vrste, sadrže specifičnu kombinaciju određenih struktura neophodnih za rast i razviće, i to:

• korenov sistem (primarni koren, sekundarni i seminalni koren);
• izdanak (hipokotil, epikotil, mezokotil, vršni - temeni pupoljak);
• kotiledoni;
• koleoptil (sve Gramineae).

3.2. U kategoriju normalno razvijenih klijanaca spadaju:

• neoštećeni, zdravi klijanci, kod kojih su osnovne strukture dobro razvijene;
• klijanci sa slabim mehaničkim oštećenjem osnovne strukture koji po razvoju ne zaostaju za neoštećenim klijancima;
• klijanci sa sekundarnim neparazitnim infekcijama prouzrokovanim gljivama i bakterijama.

3.2.1 Neoštećeni, zdravi klijanci, sa dobro razvijenim korenovim sistemom koji se sastoji od:

• dugačkog i vitkog primarnog korena, obično pokrivenog mnogobrojnim korenovim dlačicama, koji se završava tankim vrhom;
• sekundarnog korenja, koje se razvilo u toku propisanog perioda ispitivanja;
• nekoliko seminalnih korenova, umesto jednog primarnog korena kod nekih rodova, uključujući rodove: Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Triticosecale, Cyclamen.

Dobro razvijen izdanak i temeni pupoljak:

• upravno izdužen i vitak hipokotil kod vrsta sa epigealnim tipom isklijavanja;
• dobro razvijen epikotil kod vrsta sa hipogealnim tipom isklijavanja;
• dobro razvijen hipokotil i epikotil kod pojedinih rodova sa epigealnim tipom isklijavanja;
• izdužen, dobro razvijen mezokotil kod pojedinih rodova Gramineae.

Kotiledoni:

• jedan kotiledon monokotila ili izuzetno dikotila (ako je zelene boje slične listu ili promenjen, ali čitav ili delimično u semenu);
• dva kotiledona dikotila sa epigealnom klijavošću, ako su zeleni i slični listu, veličine i oblika koji variraju unutar vrsta koje se ispituju. U klijancima koji pokazuju hipogealni tip isklijavanja oni su hemisferični, mesnati (zadebljali) i ostaju delimično u omotačku semena.

Primarni listovi:

• zeleni i dobro razvijeni;
• jedan primarni list, kome ponekad prethodi nekoliko naizmeničnih slojeva listova u klijancu;
• dva primarna lista, jedan nasuprot drugom u klijancu.

Vršni pupoljak ili izdanak, čiji razvoj varira zavisno od vrste koja se ispituje.

Dobro razvijena i izdužena koleoptila kod Gramineae, koja obuhvata zeleni list koji doseže iznad polovine dužine koleoptile ili je ponekad već izašao iz nje.

3.2.2 Klijanci sa slabim (blagim) oštećenjem, gde se sledeća oštećenja smatraju slabim:

• primarni koren sa ograničenim oštećenjem ili neznatno zaostalim, retardiranim porastom;
• primarni koren oštećen, ali sa dobro razvijenim sekundarnim korenovima kod nekih rodova Leguminosae (krupno seme rodova Phaseolus, Pisum, Vicia) i Gramineae (npr. Zea) i kod svih rodova Cucurbitaceae i Malvaceae;
• samo dva dobro razvijena seminalna korena kod rodova Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Triticosecale;
• hipokotil, epikotil i mezokotil sa ograničenim oštećenjem;
• kotiledoni sa slabim i ograničenim oštećenjem (ako je polovina ili više od polovine ukupne površine tkiva normalno i ako nije vidljivo oštećenje ili trulež oko vršnog dela izdanka ili okolnog tkiva prouzrokovanog saprofitnim mirkoorganizmima);
• samo jedan normalan kotiledon kod dikotila (ako nije vidljivo oštećenje ili trulež oko vršnog dela izdanka ili okolnog tkiva prouzrokovano saprofitnim mikroorganizmima);
• tri kotiledona umesto dva (pod uslovom da je polovina ili više od polovine normalne veličine);
• primarni listovi sa ograničenim oštećenjem (ako je polovina ili više od polovine ukupnog tkiva sposobno za normalne funkcije);
• samo jedan primarni list (rod Phaseolus, ako nema vidljiva oštećenja ili truleži prema vršnom pupoljku);
• primarni listovi (Phaseolus) pravilnog oblika, smanjene veličine, ali širi od četvrtine normalne veličine;
• tri primarna lista umesto dva (npr. Phaseolus) pod uslovom da je najmanje polovina normalne veličine;
• koleoptila sa ograničenim oštećenjem;
• koleoptila napukla od vrha naniže, ali ne više od trećine svoje dužine;
• koleoptila povijena ili omčasta (usled toga što je dugo bila u plevi ili omotaču semena);
• koleoptila sa zelenim listom, koji doseže najmanje do polovine dužine koleotpile.

3.2.3. Klijanci sa sekundarnom infekcijom, truli klijanci napadnuti gljivama ili bakterijama, računaju se kao normalni ako je vidljivo da seme nije razlog infekcije i ako se oceni da su bile prisutne sve osnovne strukture.

3.3. Nenormalni klijanci su oni za koje se oceni da nemaju sposobnost da se razviju u normalnu biljku u povoljnim poljskim uslovima, jer je jedna osnovna struktura ili više osnovnih struktura nepovratno oštećeno. Nenormalni klijanci se ne uračunavaju u procent klijavosti. U nenormalne klijanice ubrajaju se tri glavne grupe, i to:

• oštećeni (nedostaje ili je oštećena bilo koja osnovna struktura);
• deformisani i neizbalansirani (defektna, nerazvijena, fiziološki poremećena, neproporcionalna bilo koja od bitnih struktura);
• istruo (truli klijanci, odnosno obolele ili trule neke od osnovnih struktura usled primarne infekcije semena nesposobnog za razvoj).

Klijanci sa jednim oštećenjem ili kombinacijom tih oštećenja ubrajaju se u nenormalne klijanice:

3.3.1. Primarni koren: zakržljao zadebljan, nerazvijen, nedostaje, slomljen, napukao od vrha, vretenast, sužen, zatvoren omotačem semena, sa negativnom geotropijom, staklast, truo kao rezultat primarne infekcije, sa jednim sekundarnim korenom ili bez sekundarnih korenova. Seminalni koren: samo jedan ili nijedan. Klijanci sa sekundarnim ili seminalnim korenima koji pokazuju jedan ili više navedenih nedostataka ne mogu zameniti primarni koren.

Kad postoji nekoliko sekundarnih korenova (npr. Cucumis), ili najmanje dva seminalna korena (npr. Triticum) ocenjuju se kao normalni klijanci.

3.3.2. Hipokotil, epikotil, mezokotil: kratak i zadebljao (osim kod Cyclame, gde mora formirati zadebljanje - gomolj), duboko napuknut ili polomljen, skroz rascepljen, ako nedostaje, sužen, veoma uvijen i usukan, previjen, formira omčice ili spirale, vretenast, staklast, truo kao rezultat primarne infekcije.

3.3.3. Kotiledoni (pravilo je da ih je 50% i više): zadebljani i kovrdžavi, deformisani, polovljeni ili drugačije oštećeni, odvojeni ili da nedostaju, obezbojeni, nekrotirani, staklasti, truli kao rezultat primarne infekcije.

Klijanci čiji su kotiledoni oštećeni ili truli na mestu na kome su srasli sa osom klijanca ili oko vršnog izdanka ocenjuju se kao nenormalni, bez obzira na veličinu oštećenja.

Posebna oštećenja kotiledona kod Allium spp.: kratak i zadebljao, sužen, previjen, formira omčicu ili spiralu, bez izraženog "kolena", vretenast.

3.3.4. Primarni listovi (pravilo je da ih je 50% ili više): deformisani, oštećeni, da nedostaju, obezbojeni, nekrotirani, truli kao rezultat primarne infekcije, normalnog oblika, ali manji od četvrtine normalne veličine.

3.3.5. Vršni pupoljak i okolna tkiva: deformisani, oštećeni, nedostaju, truli kao rezultat primarne infekcije.

Ako je vršni pupoljak oštećen ili nedostaje, klijanac je nenormalan čak i kada su jedan ili dva pazušna pupoljka (Phaseolus) ili izdanka (Pisum) već razvijeni.

3.3.6. Koleoptila i prvi list (Gramineae):

Koleoptila: deformisana, oštećena, nedostaje, sa oštećenjem ili bez vrha, znatno savijena, oblikuje omču ili spiralu, čvrsto uvijena, napukla više od trećine dužine od vrha, napukla u bazi, izdužena i vretenasta, trula kao rezultat primarne infekcije.

Prvi list: zaostao u razvoju (doseže ispod polovine normalne dužine koleoptile), nedostaje, oštećen, raskinut, kovrdžav ili drukčije deformisan.

3.3.7. Klijanac u celini: deformisan, odlomljen i oštećen, pojava kotiledona pre korena, spojena dva klijanca, žut ili beo, izdužen i vretenast, staklast, truo kao rezultat primarne infekcije.

3.4. Višeklično seme poseduje neke biljne vrste. Iz njega se može dobiti više od jednog klijanca u slučaju kad:

• seme sadrži više od jednog pravog semena (višesemenske jedinice Dactylis i Festuca, neodvojene šizokarpije Umbelliferae, klupka Beta vulgaris i dr.);
• pravo seme sadrži više od jednog embriona (javlja se obično kod poliembrih vrsta) ili izuzetno u drugim vrstama (blizanci), kad je jedan od klijanaca slab ili vretenast, a ponekad su oba normalne veličine;
• sjedinjen embrion (ponekad dva klijanca spojena, a nastala iz jednog semena).

3.5. Neklijavo seme je seme koje ne klija do isteka vremena predviđenog za trajanje ispitivanja:

3.5.1. Tvrdo seme je oblik dormantnosti, zajednički mnogim vrstama Leguminozae, ali se može javiti i kod drugih familija. To seme ne može upiti vodu u okviru datih uslova i zato ostaje tvrdo.

3.5.2. Sveže seme, koje nije tvrdo, a nije ni isklijalo do kraja ispitivanja rezultat fiziološke dormantnosti. Ono može upiti vodu u datim uslovima, ali mu je budući razvoj blokiran, iako je očito sposobno za život.

3.5.3. Mrtvo seme: meko, obezbojeno ili promenjene boje, plesnivo, često napadnuto mikroorganizmima i ne pokazuje znake razvoja klice.

3.5.4. Ostalo neklijavo seme čini:

• prazno seme koje sadrži sveži endosperm ili gametofitno tkivo u kome ne postoje embrionalna šupljina i embrion;
• sasvim prazno seme (koje je sasvim prazno ili sadrži mali ostatak tkiva);
• seme oštećeno insektima (seme koje sadrži larve insekata ili pokazuje druge vidove napada štetočina), što može uticati na sposobnost klijanja.

3.6. Klijavost se ispituje iz semena osnovne grupe "čisto seme" u propisanim uslovima.

3.7. Podloge za ispitivanje klijavosti

3.7.1 Papirna podloga može biti filtar, upijač ili papir koji dobro upija vlagu (papirni ubrusi). Ova vrsta podloge treba da bude od stoprocentno čistog drveta, pamuka ili čišćenog celuloznog vlakna, bez prisustva gljiva, bakterija ili toksičnih dodataka koji bi mogli uticati na klijavost. Papirna podloga treba da bude porozna, ali toliko sabijena da koren raste na površini i ne prodire u podlogu, pri čemu papir ne sme da se cepa. Podloga treba da upije dovoljno vode kako bi ostala vlažna sve vreme ispitivanja klijavosti, sa pH vrednošću između 6,0 i 7,5. Papirna podloga čuva se u hladnom, sterilnom i suvom prostoru, zaštićena od mogućih oštećenja.

Nepoznati kvalitet papirne podloge proverava se biološkim testom tako što se upotrebi za ispitivanje klijavosti vrsta osetljivih na toksička jedinjenja (npr. Phleum pratense, Agrostis gigantea, Eragrostis curvula, Festuca rubra var. commutata i Lepidium sativum). Tada se upoređuje razvijenost korena na poznatoj i nepoznatoj podlozi pri prvom ocenjivanju klijanaca.

3.7.2. Pesak treba da bude ujednačen, a veličina zrna takva da propadaju kroz sito prečnika otvora 0,8 mm i ostaju na situ čiji su otvori prečnika 0,05 mm. Pesak ne sme da sadrži strane primese, seme, gljivice, bakterije, organske ili toksične materije koje bi mogle uticati na klijavost. Vlaga navlaženog peska treba da bude optimalna za sve vreme trajanja klijavosti i ne sme biti toliko vode da ne bi bilo moguće kruženje vazduha kroz podlogu. Vrednost pH treba da bude između 6,0 i 7,5. Pesak treba po potrebi sterilisati i prati i, kao takav, može se upotrebljavati više puta ako seme koje se ispituje nije hemijski tretirano.

3.7.3. Zemlja treba da bude dobrog kvaliteta, bez primesa krupnih čestica, gljivica, bakterija, nematoda ili toksičnih i hemijskih materija koje mogu uticati na klijavost. Vlažnost treba da omogući dostup vazduha do korena koji se razvija, sa pH vrednošću između 6,0 i 7,5. Ako zemlja sadrži pomenute nepoželjne primese ili materije ili se više puta upotrebljava, mora se sterilisati po istom postupku kao pesak.

3.7.4. Voda ne sme sadržati organske i neorganske primese, a može se koristiti destilisana ili dejonizovana voda sa pH vrednosti između 6,0 i 7,5.

3.8. Oprema za postavljanje semena na klijanje

3.8.1. Ploča za brojanje: upotrebljava se obično pri raspoređivanju krupnozrnastog semena na klijavu podlogu. Ima 50 ili 100 ravnomerno raspoređenih otvora na gornjoj ploči, a kad se oni napune semenom, donja ploča ili dno se izmakne i seme pada na podlogu.

3.8.2. Vakuumski brojači: upotrebljavaju se za pravilno oblikovano i glatko seme (žita, Brassica, Trifolium). Na otvore glave za brojanje usisa se 50 ili 100 semena koja se prekidanjem sistema za usisavanje spuštaju na podlogu za klijanje. Glave su različite veličine, a otvori, čiji je prečnik različit kako bi odgovarao vrsti semena, obično se nalazi u krugu. U svakom otvoru treba da bude samo jedno seme. Glave za brojanje ne smeju se potopiti u seme, jer se tako usisava samo lakše seme.

3.9. Klijališta

3.9.1. Jakobsen aparat (Copenhagen tip klijališta) sastoji se od ploče za klijanje na koju se stavlja filtrir-papir sa semenom. Filtar se neprestano vlaži pomoću trake koja kroz otvore dopire u sud sa vodom. Filtar sa semenom pokriva zvono na čijem se vrhu nalazi otvor za zračenje. Temperatura se najčešće reguliše automatski. Aparat je upotrebljiv za sve konstantne ili izmenljive temperature.

3.9.2. Komora za klijanje je zatvoren prostor za klijanje semena u tami ili na svetlosti. Savremene komore imaju sistem za hlađenje i grejanje, kojim se automatski regulišu odgovarajuća temperatura (koja se menja ili je ravnomerna) i svetlost i vlažnost vazduha (ako je "vlažna komora"). Ako je temperatura u komori ujednačena, a traži se temperatura koja se menja, testove treba prenositi iz jedne komore u drugu komoru sa odgovarajućom temperaturom. U suvoj komori testovi treba da budu u zatvorenim sudovima koji su preporučljivi i za vlažne komore.

3.9.3. Soba za klijanje radi na istom principu na kome radi i komora za klijanje, samo što je veća i prohodna za čoveka. Osvetljavanje, temperatura i vlažnost vazduha automatski se regulišu i kontrolišu.

3.9.4. Radni uzorak predstavlja 4 × 100 semena koja se uzimaju nasumice iz osnovne grupe "čisto seme" i ravnomerno raspoređuju na odgovarajuću podlogu za klijanje. Ponavljanja zavise od vrste semena i posude za klijanje, a mogu se podeliti na potponavljanja od 8 · 50 ili 16 · 25 semena. Ako je seme jako inficirano, pri ponovnom brojanju se može premestiti na novu papirnu podlogu.

3.10. Uslovi za ispitivanje klijavosti semena po biljnim vrstama dati su u tabeli 12 u okviru normi kvaliteta i uslova za klijanje semena.

3.11. Metode korišćenja podloga za klijanje

3.11.1. Papirne podloge:

• Na papir: seme klija na jednoj ili više papirnih pologa u Jakobsen aparatu, u posebnim posudama ili Petrijevim kutijama ili neposredno na pločama u komorama za klijanje (ako je vlaga u njima dovoljno visoka).
• Između papira: seme klija između dva sloja papirne podloge, i to tako da se pokrije slojem papira ili se stavlja između naboranog papira ili između papira koji se savija u rolne i stavlja vodoravno ili vertikalno u komoru. Seme može klijati u plastičnim sudovima ili neposredno na pločama komora za klijanje pod uslovom da je vlažnost vazduha blizu granice zasićenosti.
• Naborani papir: seme klija između bora papira u sudovima ili u "vlažnoj" komori za klijanje.

3.11.2. Pesak

Na pesku: seme se seje na površinu peska.

U pesku: seme se stavlja na sloj vlažnog peska i pokrije slojem istog peska debljine 10 do 20 mm, ali tako da se postigne provetravanje. Umesto papirne podloge, zbog razvoja bolesti, može se upotrebiti pesak. Pesak se ponekad upotrebljava i prilikom istraživanja razvoja sumnjivih klijanaca, iako je za to zemlja prikladnija.

3.11.3. Zemlja ili kompost nisu preporučljivi za prvo ispitivanje, jer je teško dobiti ravnomernu podlogu i kad klijanci pokazuju fitotoksične znake ili ako je njihov razvoj na papiru sumnjiv. Zemlja se najčešće upotrebljava za komparativno ispitivanje ili u istraživačke svrhe, pri čemu se preporučuje samo jednokratna upotreba.

3.12. Vlažnost i pristup vazduha

Za sve vreme klijavosti podloga treba da je dovoljno vlažna, ali ne sme sadržati mnogo vode, koja bi onemogućavala pristup vazduha. Početna količina dodate vode zavisi od prirode i veličine podloge i veličine semena. Optimalna količina utvrđuje se probom. Treba izbegavati dodavanje vode u međuvremenu, jer to prouzrokuje razlike između ponavljanja u testu. Provetravanje testa na papiru i između papira nije potrebno, a na naboranom papiru i na pesku treba voditi računa da oko semena ima dovoljno vazduha, zbog čega se seme rastresito pokriva pri primeni metoda i sa peskom i sa zemljom.

3.13. Temperatura

Na propisanu temperaturu, tolerancija može da iznosi najviše ±1 °C. Ako su propisane naizmenične temperature, niža temperatura treba da traje 16, a viša 8h. Prelazak sa jedne temperature na drugu temperaturu može trajati do 3h, a za seme koje je u fazi mirovanja temperatura treba da se promeni u roku od 1h ili brže ili da se testovi prenesu u drugi prostor za klijanje sa nižom temperaturom. Ako se menjanje temperature ne može nadzirati (nedelje, praznici), testovi se ostavljaju na nižoj temperaturi.

3.14. Osvetljavanje

Seme klija na svetlosti ili u tami. Osvetljavanje veštačkom ili dnevnom svetlošću preporučljivo je za bolji razvoj klijanaca, koji u potpunoj tami etioliraju i mogu biti napadnuti mikroorganizmima, što otežava ocenjivanje klijavosti. Kod trava, na primer, svetlost ubrzava klijavost, a u drugim slučajevima (npr. Phacelia tanacetifolia) ometa klijavost, zbog čega se daju posebne preporuke za osvetljavanje ili tamu.

3.15. Kad na kraju ispitivanja ostane previše tvrdog ili svežeg semena (npr. fiziološko mirovanje - dormantnost - inhibitorne supstancije, tvrdo seme) ili ako se pretpostavlja da će kod semena nastati takva pojava, predviđeno je više metoda kojima se može dobiti potpuniji uvid u klijavost semena.

3.15.1. Metode za prekidanje mirovanja semena:

• suvo čuvanje: seme koje po prirodi zahteva duže vreme mirovanja produženo se čuva u suvoj prostoriji;
• prethodno hlađenje: seme poljoprivrednog bilja, povrća i cveća obično se prethodno hladi na podlogama za klijanje, na temperaturi od 5 do 10 °C, sedam i više dana pre nego što se stavi na propisanu temperaturu. Ponekad prethodno hlađenje treba produžiti ili ponoviti, s tim što se ono ne ubraja u vreme potrebno za klijanje;
• prethodno grejanje semena na podlogama za klijanje je neophodno u nekim slučajevima na temperaturi 30 do 35 °C, sedam ili više dana pre nego što se stavi u propisane uslove za klijanje. To vreme se ne ubraja u vreme potrebno za klijanje. Za neke tropske i suptropske vrste potrebna je temperatura od 40 do 50 °C (npr. Arachis hypogea 40 °C);
• osvetljenje: test se osvetljava osam sati u trajanju od 24 h u periodu kad je viša temperatura i pri temperaturi koja se menja. Intenzitet osvetljavanja hladnom belom svetlošću treba da iznosi 750 do 1.250 luksa. Osvetljavanje se preporučuje pogotovo za tropske i suptropske trave (npr. Cynodon dac tylon);
• kalijum-nitrat (KNO₃) : (0,2%-ni vodeni rastvor) kojim se na početku vlaži podloga za klijanje. Prilikom kasnijeg vlaženja upotrebljava se voda;
• giberelinska kiselina (GA₃) : preporučuje se za vrste Avena sativa, Hordeum vulgare, Secale cereale, Triticosecale i Triticum aestivum. Podloga za klijanje vlaži se 0,05% rastvorom GA₃. Ako je mirovanje semena oslabilo, dovoljno je 0,02%, a ako je jako, upotrebljava se 0,1%-ni rastvor. Ako je koncentracija veća od 0,08%, preporučuje se rastvaranje GA₃ u fosfatno pufernom rastvoru (1.7799 g Na₂ HPO₄ · 2H₂O i 1.3799 g Na H₂PO₄ · H₂O rastvara se u litru destilovane vode);
• zatvoreni polietilenski omoti se upotrebljavaju kad na kraju testiranja ostane još dovoljno svežeg semena. Ponovno testiranje u zatvorenim polietilenskim omotima odgovarajuće veličine za test preporučuje se za podsticanje klijanja svežeg semena.

3.15.2. Metode omekšavanja tvrdog semena

Karakteristično je da na kraju testa za mnoge vrste ostane tvrdo seme, koje se upisuje u deklaraciju. Da bi se dobio realiniji rezultat klijavosti, potrebno je različitim metodama uticati na sniženje procenta tvrdog semena u korist proklijalog semena.

Natapanje: seme sa tvrdim semenskim epidermom natapa se 24 do 48 h u vodi.

Mehaničko oštećenje epiderma: prekidanje uslova mirovanja zbog nepropusnog epiderma postiže se ako se seme probode, zaseče ili istrlja peskom, pri čemu se vodi računa o tome da se ne oštete embrioni, pa su mehaničke intervencije ispravnije na strani suprotnoj od embriona.

Obrada semena kiselinom: ova metoda je primenjiva kad se za omekšavanje tvrde ljuske koristi koncentrisana sumporna kiselina (H₂SO₄). Seme se natapa u kiselini toliko dugo da počinje da mreška, što traje nekoliko minuta do 1 h. Za vreme natapanja seme treba pregledati svakih nekoliko minuta i, posle natapanja, dobro oprati u tekućoj vodi i staviti da klija u odgovarajućim uslovima. Seme vrste Oryza sativa natapa se u normalnoj azotnoj kiselini (HNO₃) 24 h (posle prethodnog grejanja na temperaturi 50 °C).

3.15.3. Metode otklanjanja inhibitornih supstancija:

ispiranje: prirodne supstance u perikarpu ili u semenskom epidermu, koji su inhibitori klijavosti, mogu se otkloniti ispiranjem tekućom vodom pri temperaturi od 25 °C pre nego što se seme stavi na klijanje. Posle ispiranja seme treba osušiti na temperaturi od najviše 25 °C (npr. Beta vulgaris);

otklanjanje struktura oko semena: klijavost se može ubrzati ako se otklone razne strukture, kao što su dlačice ili pretpleva i površinska pleva kod nekih vrsta Gramineae;

dezinfekcija semena može se primeniti pre sejanja semena samo kod vrste Beta vulgaris kad se zna da seme nije tretirano.

3.16. Trajanje ispitivanja klijavosti

Dužina ispitivanja klijavosti je određena za pojedine biljne vrste. Ako se primeti da će neko seme i posle tog roka klijati, vreme klijavosti produžava se do sedam dana ili za polovinu propisanog vremena, što se mora evidentirati, a kad se najveća moguća klijavost postigne brže, ispitivanje se može završiti pre propisanog vremena. Vreme prvog ocenjivanja dato je približno, ali mora odgovarati vremenu kad su klice dostigle razvojnu fazu u kojoj se mogu oceniti njihove bitne osobine. Vreme za ocenjivanje dato je za najviše temperature, a pri nižim temperaturama prvo ocenjivanje se pomera za kasnije. Za ispitivanje u pesku, koje traje 7 do 10 dana, prvo ocenjivanje se može izostaviti. Ako je potrebno, ocenjivanje se može izvršiti u međuvremenu i otkloniti dobro razvijeni klijanci. Datume ocenjivanja određuje analitičar, imajući na umu najmanji rizik oštećenja nedovoljno razvijenih klijanaca.

3.17. Ocenjivanje

3.17.1. Klijanac: pri prvom i svim ostalim ocenjivanjima izdvajaju se klijanci čije su sve životno potrebne strukture dobro razvijene. Oboleli klijanci, uz obavezno utvrđivanje prouzrokovača, izdvajaju se pre konačnog brojanja. Nedovoljno razvijeni i nenormalni klijanci, kao i neklijavo seme ostavljaju se do kraja ispitivanja klijavosti. Ako se pojavljuju znaci ograničenog razvoja ili fitotoksičnosti, ispitivanje treba ponoviti u pesku ili u zemlji, pri temperaturi koja je propisana za tu vrstu semena.

3.17.2. Svaka višesemenska jedinica sa jednim klijancem ili više klijanaca računa se kao jedan procent klijavosti. Ako se traži nalaz po broju klijanaca na 100 jedinica ili po broju jedinica koje daju jedan, dva ili više klijanaca, u klijavost se ubrajaju svi normalni kijanci.

3.17.3. Neklijavo seme:

• tvrdo seme: na kraju vremena propisanog za klijanje, tvrdo seme se broji, a njegov procent upisuje u rubriku izveštaja: "tvrdo seme";
• sveže seme: koriste se preporuke za ubrzavanje klijavosti, pogotovu ako je veliki broj svežih semena. Vitalnost svežeg semena može se utvrditi i biohemijskom metodom ili presecanjem i upisati u izveštaju kao "sveže seme";
• mrtvo seme; ne klija, a nije tvrdo ni sveže, već meko i plesnivo, uz obavezno utvrđivanje prouzrokovača;
• ostalo neklijavo seme: prazno seme i seme koje nije proklijalo. Na zahtev, navodi se broj praznih semena (koje su oštetile štetočine) ili semena bez embriona.

Za utvrđivanje tih grupa mogu se primeniti sledeće metode:

1. pre ispitivanja klijavosti - zračenjem testa X zracima kojima se zrače ponavljanja za ispitivanje klijavosti i presecanjem semena, gde se svako od četiri ponavljanja po 100 semena posebno natapa u vodi 24 h (-) na sobnoj temperaturi, a svako seme preseče po uzdužnoj osi i ocenjuje; 
2. posle ispitivanja klijavosti, sveže seme, koje nije proklijalo, se preseca i ocenjuje. Ako se primeni tetrazol-test (biohemijska metoda), prilikom pripremanja ocenjuje se i procent praznog semena i semena koje su ozledile štetočine.

3.18. Ponavljanje ispitivanja

Ako rezultat ispitivanja nije prihvatljiv, ispitivanje će se ponoviti po istom postupku ili će se odabrati drugi pogodniji metod. Razlozi za ponovno ispitivanje jesu:

• sumnja na mirovanje semena (sveže seme);
• utvrđene (nađene) ekonomski bezopasne biljne bolesti i štetočine;
• greške u odnosu na propisane uslove za razvoj klica ili greške u ocenjivanju.

3.19. Ispitivanje klijavosti semena sa omotačem

Seme sa omotačem iz osnovne grupe "čistog semena" ispituje se tako što se omotač semena ne uklanja. Za podlogu klijanja upotrebljava se papir, pesak, i, u nekim slučajevima, zemlja. Za seme sa omotačem upotrebljava se naborani papir (preporuka: naborani papir težine 100 do 120 g na 1 m² i naborani filtar u težini 70 g na 1 m², uz sposobnost apsorpcije vode 220 do 240%). Sadržaj vode varira zavisno od omotača semena i vrste bilja. Ako je omotač semena pripijen uz kotiledone, treba ga isprati raspršivanjem vode. Seme iz trake stavlja se između papira i savija u vertikalne smotuljke. Radni uzorak predstavlja 4 · 100 semena sa omotačem. Seme u trakama otkida se po slučajnom izboru da bi se u malim delovima na traci sastavila četiri ponavljanja po 100 semena. Aparati i uslovi ispitivanja jednaki su kao za seme bez omotača, a isti su i uslovi za prekidanje mirovanja. Usporavanje klijavosti može biti posledica neodgovarajućih uslova za klijanje ili čvrstog omotača semena. Ocena razvoja klijanaca, kao i višenamenskih jedinica ista je kao ocena klijavosti semena bez omotača. U izveštaju se saopštava procent normalnih i nenormalnih klijanaca i mrtvog semena. Za seme u trakama saopštava se broj normalnih klijanaca na metru trake.

3.20. Izračunavanje i saopštavanje rezultata

Rezultat se daje kao procent broja normalnih i nenormalnih klijanca, tvrdog, svežeg i mrtvog semena, koji ukupno iznosi 100. Svako ponavljanje izračunava se posebno (ako ima 25 ili 50 semena, u rezultatu se zbrajaju ponavljanja 4 · 25 ili 2 · 50 semena). Prosečni procent svih ponavljanja izražava se u celom broju, bez decimala.

Rezultat najvećeg i najmanjeg procenta kod ponavljanja treba da bude u granicama dozvoljenog odstupanja, kao i u slučajevima kad se isti uzorak ispituje dva puta.

Ako su odstupanja veća, ispitivanje je potrebno ponoviti.

Tabela 5
Najveća moguća tolerancija među ponavljanjima

Tabela pokazuje najveću razliku u procentu klijanja koja se toleriše između ponavljanja. Dozvoljeno odstupanje između vrednosti uzoraka toleriše se sa 0,025 verovatnoće. Da bi se odredila najveća moguća tolerancija, izračuna se prosečan procent za sva četiri ponavljanja, za najbliži ceo broj. Odredi se prosek procenata klijavosti u kolonama 1 i 2 tabele i u koloni 3 pročita najveća moguća tolerancija.

Tabela 6
Podudarnost ispitivanja

Ova tabela pokazuje toleranciju koja se može uzeti pri odlučivanju da li su, za probu po slučajnom izboru varijacije dva ispitivanja podudarna sa samo 0,025 verovatnoće. Da bi se ustanovilo da li su dva ispitivanja podudarna, izračunava se prosek procenata klijanja od dva ispitivanja, za najbliži ceo broj i odredi se u kolonama 1 i 2 ove tabele. Testovi su podudarni ako razlika između procenata klijanja dva ispitivanja ne prelazi toleranciju datu u koloni 3.

4. Biohemijsko ispitivanje vitalnosti semena (topografski tetrazol-test)

4.1. Biohemijsko ispitivanje primenjuje se za brzo utvrđivanje vitalnosti semena uopšte, a pogotovu u slučaju dugotrajnog mirovanja (dormantnosti) semena:

• ako je na kraju ispitivanja klijavosti ostalo dosta neklijalog mirujućeg (dormantnog) semena, utvrđuje se vitalnost pojedinog mirujućeg semena ili vitalnost radnog uzorka;
• test važi za sve biljne vrste za koje su navedeni metode.

4.2. Sredstva za biohemijsko ispitivanje

U topografskom tetrazol-testu upotrebljava se bezbojni rastvor 2, 3, 5, - trifenil-tetrazol-hlorida ili bromida kao indikator redukcijskih procesa koji se u živim ćelijama odvijaju pomoću hidrogenaze. Pri tom se stvara trifenil-formazan, koji žive ćelije oboji u crveno, a mrtve ostaju neobojene. Pored potpuno obojenog i potpuno neobojenog neživog semena nalazi se i delimično obojeno seme. Po razlikama delova nekrotičnog tkiva, po mestu i veličini u embrionu i/ili endospermalnom, gametofitnom tkivu i po intenzivnosti bojenja utvrđuje se koje se seme ocenjuje kao živo, a koje kao neživo. Razlike u boji odlučujuće su za utvrđivanje zdravog, oslabljenog ili mrtvog tkiva.

Upotrebljava se 0,1% do 1,0% vodenog rastvora 2, 3, 5-trifenil-tetrazol-hlorida ili tetrazol-bromida. Za različite vrste, koncentracija varira. Ako prah-rastvori destilisane vode nisu u granicama pH vrednosti 6,5 do 7,5 rastvor treba pripremiti po sledećem postupku:

1. rastvor čini 9,078 g KH₂PO₄ u 1.000 ml vode;
2. rastvor čini 9,472 g NA₂HPO₄ u 1.000 ml vode ili 11,876 g Na₂HPO₄ · 2H₂O u 1.000 ml vode.

Pomešaju se dva dela rastvora A sa tri dela rastvora B. U toj smeši se rastvori potrebna količina tetrazolove soli (ili hlorid ili bromid) kako bi se dobila željena koncentracija (npr. 1 g soli u 100 ml mešovitog rastvora daje 1%-ni rastvor).

4.3. Radni uzorak čini 4 · 100 semena odabranih po slučajnom izboru iz osnovne grupe "čisto seme" ili pojedinačna semena koja su ocenjena da na kraju ispitivanja klijavosti još miruju.

4.4. Pripremanje semena i postupci

4.4.1. Natapanje semena pre bojenja preporučuje se za sve vrste bilja. Navlaženo seme manje je krhko od suvog semena, lakše se zaseče ili probode i bojenje je ravnomernije. (Vreme natapanja navedeno je u tabeli). Ako semenska kožica ne dozvoljava bubrenje semena, treba je probosti.

• Sporo vlaženje preporučuje se za seme koje se zalomi u vodi ili za staro i suvo seme. Seme se vlaži između dva vlažna papira. Seme nekih vrsta prilikom sporog vlaženja ne nabrekne pa ga treba potapati u vodu.
• Natapanje u vodi: seme se natopi u vodi, a ako natapanje traje 24h, vodu treba zameniti. Procent tvrdog semena kod familije Leguminosae utvrđuje se natapanjem tokom 22h na temperaturi 20°C, jer ostali postupci ne daju ispravne rezultate.

4.4.2. Pripremanje semena pre bojenja: pripremanje semena treba da bude precizno kako se ne bi oštetili životno značajni delovi tkiva. Za otvaranje ili otklanjanje semenske kožice primenjuju se različite tehnike. Tako pripremljeno seme treba da bude natopljeno do kraja pripreme svih ponavljanja. Vreme prethodnog natapanja seme nekih vrsta bilja postaje sluzavo. Sluz se otklanja površinskim sušenjem ili se seme obriše krpom ili papirnim ubrusom ili natapa pet minuta u 1 do 2%-nom rastvoru aluminijum-kalijumovog sulfata - AlK (SO₄)2 · 12H₂O.

Seme koje je prethodno natopljeno ili tvrdo probada se iglom ili skalpelom na životno beznačajnoj strani semena.

Dužinski rez - raspolovljavanje:

• žita i trave veličine Festuca spp. i veće režu se po dužini, posred embrionalne ose i približno tri četvrtine dužine endosperma;
• vrste dikotila bez endosperma i sa ravnim embrijem preseku se uzdužno kroz sredinu između kotiledona, tako da embrion ostane nezasečen;
• vrstama čiji je embrion pokriven endospermom ili gametofitnim tkivom treba oprezno prerezati embrion po dužini.

Poprečni rez semena radi se na životno beznačajnim delovima tkiva:

• seme trave reže se iznad embriona, a embrionalni deo se boji. Semenu dikotila bez endosperma i sa ravnim embrionom odseče se trećina kotiledona;
• poprečni rez je metoda pogodna za sitno seme trave veličine Agrostis, Phleum i Poa;
• ljuštenje embriona je metoda koja se primenjuje za ječam, raž i pšenicu. Lancetom se izdube embrioni sa skutelumom iz endosperma i stavljaju u rastvor tetrazola;
• otklanjanje semenskog epiderma je metoda koja se primenjuje ako prethodni postupci odgovaraju. Ako je koštica semena tvrda (oraščići i drvenasti plodovi), treba je pažljivo otvoriti ili smrviti kad je seme suvo ili posle natapanja kako se ne bi povredio embrion. Unutrašnja pokožica uklanja se posle natapanja.

4.5. Bojenje

Seme treba da bude potpuno prekriveno rastvorom tetrazola, a da nije izloženo neposrednoj svetlosti koja uzrokuje redukciju soli tetrazola. Vreme bojenja može se produžiti ako se seme dovoljno ne oboji u propisano vreme. Svetlija boja može biti posledica oštećenja posle mraza, slabog semena itd. Semenu nekih vrsta dodaje se mala količina fungicida ili antibiotika (npr. 0,01%-ni preventol 115) kako bi se sprečilo penušanje rastvora sa tamnim talogom. Sitno seme može prethodno da se navlaži na papiru koji se smota ili nabora i potom stavi u rastvor tetrazola.

4.6. Ocenjivanje: ocenjuje se živo i neživo seme. Potrebno je pažljivo oceniti karakteristike koje opredeljuju grupu živog ili neživog semena. Živo seme biće sposobno da razvije normalne klice pri testiranju klijavosati u povoljnim uslovima kad je mirovanje (dormantnost) prekinuto, i posle odgovarajuće dezinfekcije, zdravo. Živo je ono seme ili embrion koji je potpuno ili samo delimično obojen na karakterističnim delovima tkiva. Neživo seme je seme koje nema te karakteristike ili koje je nekarakteristično obojeno, odnosno koje ima mutno obojene životno značajne delove ćelije. Seme sa vidljivo nenormalno razvijenim embrionom ili nenormalnim životno značajnim delovima ocenjuje se kao neživo bilo da je obojeno ili neobojeno. Seme sa malim nekrozama na životno beznačajnim delovima ocenjuje se kao živo.

4.7. Izračunavanje i saopštavanje rezultata: broj živih semena iz svakog ponavljanja, izražen u procentu, izračunava se zajedničkim procentom najbližim celom broju. Odstupanja između ponavljanja jednaka su kao pri ispitivanju klijavosti.

U izveštaju, odnosno deklaraciju unosi se: "Tetrazol test... procent živog semena". Kod familije Leguminosea može se uneti i procent tvrdog semena nađen pri testiranju. Ako se testira pojedinačno seme, na kraju testa klijavosti rezultat se uključuje u procent semena koje klija.

Tabela 7
Postupci TETRAZOL-TESTA za vrste CORYLUS SPP., MALUS SPP., PYRUS SPP. i PRUNUS SPP.

Tabela pokazuje postupak pripremanja semena pre bojenja, bojenje (koncentraciju rastvora i vreme na temperaturi od 30°C), pripremanje za ocenjivanje i ocenu obojenih uzoraka. Seme sa potpuno obojenim embrionom i sa neobojenim ili nekrotiranim delovima kao što je prikazano u koloni 7) je sposobno za život.

5. Vlaga semena

5.1. Pod vlagom semena podrazumeva se količina vode u semenu izražena u procentu. Propisani metodi za ispitivanje vlage onemogućavaju redukciju, razgradnju ili gubitak isparljivih supstancija.

5.2. Aparati

5.2.1. Mlin za mlevenje semena treba da bude urađen od neapsorbujućeg i nekorozivnog materijala, tako da za vreme mlevenja seme ili mleveni materijal budu do najveće moguće mere zaštićeni od vazduha iz okoline, da ravnomerno usitnjava seme i ne prouzrokuje zagrevanje usitnjenog materijala, da kruženje vazduha bude normalno kako ne bi došlo do gubitka vlage i da bude pripremljen tako da odgovara zahtevima za veličinu samlevenih čestica.

5.2.2. Peć sa konstantnom temperaturom i dodacima treba da se električno zagreje i nadzire termostatom, da je dobro izolovana, da temperatura bude ravnomerna u celoj komori, da je opremljena termometrom sa preciznošću od 0,5°, da se za 15 min može ponovo zagrejati na traženu temperaturu pošto se posle prethodnog zagrevanja otvori, kako bi se u nju stavile posude.

5.2.3. Posude moraju biti od nekorozivnog metala ili stakla debljine oko 0,5 mm, da imaju poklopce koji sprečavaju gubitak vlage iz usitnjenog materijala, da su okrugli, ravnog dna i glatko brušeni. Pre upotrebe posude se suše 1 h na temperaturi 104 °C i hlade u eksikatoru. Usitnjeni materijal raspoređuje se tako da ga ima najviše 3 g na 1 cm2, a eksikator treba da omogući brzo hlađenje i da je napunjen eksikatnim materijalom.

5.2.4. Analitička vaga se koristi za brzo merenje do tačnosti od 0,001 g.

5.2.5. Sita treba da imaju otvore od 0,50 mm, 1,00 mm i 4,00 mm.

5.3. Postupci

5.3.1. Zaštitna mera: uzorak za vlagu treba da bude zatvoren u nepropustivoj ambalaži iz koje je vazduh maksimalno uklonjen, a postupak utvrđivanja vlage treba da bude brz, s tim da uzorak bude minimalno izložen spoljnoj atmosferi (laboratorije). Za vrste koje se ne melju može proteći najviše 1 min od trenutka uzimanja semena do vremena kad se radni uzorak zatvara u sud za sušenje i meri.

5.3.2. Rezultat merenja izražava se u gramima, sa tri decimale.

5.3.3. Vlaga se ispituje u dva ponavljanja iz uzorka za vlagu u količini koja odgovara veličini prečnika sudova:

• manji od 8 cm - 4 do 5 g
• veći od 8 cm - 10 g

5.3.4. Mlevenje: krupnozrno seme treba da bude usitnjeno pre sušenja, osim ako sadrži ulja, što otežava usitnjavanje i oksidacijom povećava težinu (npr. seme vrste Linum sa uljima visokog jodnog broja). Pre pripremanja radnog uzorka, usitni se uzorak za vlagu. Seme žita i pamuka usitnjava se u čestice od kojih najmanje 50% prođe kroz sito sa otvorima od 0,50 mm, a na situ sa otvorima od 1,00 mm da ostane najviše 10%. Usitnjene čestice Leguminozeae su grublje, tako da na mreži sa otvorima od 4,00 mm ostane najmanje 50%. Kad se mlin za mlevenje reguliše na poželjnu veličinu čestica najpre se usitni mala probna količina uzorka koja se odbaci, a zatim se usitni masa uzorka veća od mase potrebne za ispitivanje vlage.

5.3.5. Prethodno sušenje: za seme koje je potrebno samleti a sadržaj vlage je veći od 17% ili 10% za Glycine max. ili veći od 13% za Oryza sativa, obavezno je prethodno sušenje. Primenom dva ponavljanja od po 25 g (mereno do tačnosti od 2,0 mg), stavljaju se u izmerene posude i suše na temperaturi od 130 °C, od 5 do 10 min. Ako je vlažnost semena Zea mays iznad 25%, rasprostire se u sloju debljine do 20 mm i suši na temperaturi 70 °C, od dva do pet sati zavisno od početne količine vlage. Ostale vrste čije seme sadrži vlagu veću od 30%, suše se noću u toploj prostoriji (npr. na peći). I u ostalim slučajevima seme se prethodno suši u peći na konstantnoj temperaturi od 130 °C u trajanju od 5 do 10 min. Dosušeno seme ostavlja se u laboratorijskim uslovima 2 h. Posle prethodnog sušenja uzorci u posudama ponovo se mere kako bi se utvrdila količina gubitka vlage, a zatim se oba ponavljaju, melju i ispituju po sledećim metodama:

• metoda sa niskom konstantnom temperaturom: radni uzorak raspoređuje se u posude za sušenje koja se meri s poklopcem pre i posle punjenja. Sudovi sa otvorenim poklopcima zatim se brzo stavljaju u peć za sušenje na temperaturi od 103 °C ± 2 °C za 17 h ± 1h. Sušenje počinje kad je temperatura u peći ponovo na traženoj visini. Posle isteka propisanog vremena sudovi se pokriju i prenesu u eksikator u kome se hlade 30 do 45 min. i mere, sa poklopcima, u uslovima relativne vlage ispod 70%;
• metoda sa visokom konstantnom temperaturom: sa radnim uzorkom postupa se kao i kad se primenjuje prethodna metoda, s tim što temperatura sušenja iznosi 130 do 133 °C, a vreme: 4h za Zea mays, 2h za druga žita i 1h za druge vrste kulturnog bilja, a za visinu relativne vlage u okolini nema posebnih zahteva.

5.4. Izračunavanje i saopštavanje rezultata

Sadržaj vlage saopštava se (izračunava) u procentu, na jednu decimalu, po sledećoj formuli:

gde je:
M₁ - masa posude i poklopca u gramima;
M₂ - masa posude, poklopca i sadržaja pre sušenja;
M₃ - masa posude, poklopca i sadržaja posle sušenja.

Ako je seme prethodno sušeno, uvažavaju se oba rezultata (iz prethodnog sušenja i sušenja). Ako je S₁ gubitak vlage u prvoj fazi i gubitak vlage u drugoj fazi, oba se računaju po gornjoj formuli i izražavaju u procentima.

Procent stvarne vlage izračunava se po obrascu:

Tabela 8
Vrste kod kojih se uzorak za ispitivanje vlage melje

Tabela 9
Vrste koje se suše na niskoj stalnoj temperaturi

Tabela 10
Vrste koje se suše na visokoj stalnoj temperaturi

5.5. Dozvoljena odstupanja pri utvrđivanju sadržaja vlage u semenu

5.5.1. Kao rezultat, izračunava se aritmetička sredina oba ponavljanja. Ako razlika između oba rezultata iznosi više od 0,2%, postupak treba ponoviti.

5.5.2. Za vrste semena Malus spp., Pyrus spp. i Prunus spp. i sl., dozvoljena su odstupanja između 0,3% do 2,5%, zavisno od veličine semena.

Tabela 11
Dozvoljeni nivo razlika između dva određivanja sadržaja vlage semena voća

6. Masa 1.000 semena

6.1. Ispitivanje mase 1.000 semena vrši se uzimanjem 1.000 semena od frakcije "čisto seme" i njihovim merenjem utvrđuje prosečna masa 1.000 semena, izražena u gramima.

Za uzimanje semena služi poseban ili običan aparat za brojenje koji se upotrebljava pri ispitivanju klijavosti. Radni uzorak može biti cela frakcija "čisto seme" ili ponavljanja u ovoj frakciji.

6.2. Postupci brojanja

6.2.1. Brojanje celog radnog uzorka: ceo radni uzorak (frakcija "čisto seme") propušta se kroz aparat, a broj očitava na indikatoru, meri, u gramima, na isti broj decimala kao pri analizi čistoće.

6.2.2. Brojanje ponavljanja: iz radnog uzorka, po principu slučajnosti (ručnoj) ili brojačem za klijavost, odabere se osam ponavljanja, svako po 100 semena, koja se mere na isti broj decimala kao pri analizi čistoće, i izračunava varijansa, standardna devijacija i varijacijski koeficijent, po sledećim obrascima:

gde je:
x - masa svakog ponavljanja, u gramima;
n - broj ponavljanja;
S - zbir (suma).

x = prosečna masa 100 semena.

Ako varijacijski koeficijent ne prelazi 6,0 za plevaste trave ili 4,0 za drugo seme, može se izračunati rezultat. Kad varijacijski koeficijent prelazi bilo koji od tih limita, onda se to navodi, ponovo meri osam ponavljanja i standardna devijacija izračunava za 16 ponavljanja, a izdvaja se svako ponavljanje koje odudara od proseka za više od dvostruke standardne devijacije.

6.3. Izračunavanje i saopštavanje rezultata

6.3.1. Ako je brojanje vršeno aparatom iz količine celog radnog uzorka, izračunava se masa 1.000 semena. Ako se računaju ponavljanja osam ili više puta po 100 semena, onda se broj ponavljanja pomnoži sa prosečnom masom 100 semena i dobije prosečna masa 1.000 semena (npr. 10 puta x).

6.3.2. Masa i veličina semena sa omotačem ispituju se tako što se broji čista frakcija 1000 semena sa omotačem, meri i izračunava. Za taj postupak uzima se uzorak odgovarajuće veličine, proseje sitom (čistoća semena sa omotačem) i svaka prosejana frakcija determiniše. Za utvrđivanje mase upotrebljavaju se odgovarajući aparati za brojanje, a za utvrđivanje veličine - odgovarajuća sita po postupcima određenim za utvrđivanje čistoće obloženog semena (preporuka za Beta seme i za polirano seme).